熒光素鉀鹽是熒光素酶的水溶性底物,存在于多種發(fā)光生物體中。在ATP和熒光素酶的催化作用下,D-熒光素鉀被氧化,產(chǎn)生藍(lán)綠色的光(560nm),當(dāng)?shù)孜镞^量時(shí),產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)。編碼熒光素酶的Luc基因是植物、**、哺乳動(dòng)物細(xì)胞的常用報(bào)告基因。由于沒有背景干擾,因此可以很容易地檢測(cè)出低至0.02 pg 水平的熒光素酶。
熒光素鉀鹽可使luc標(biāo)記基因和熒光素酶融合蛋白在活細(xì)胞、組織和生物體的表達(dá)成像,廣泛應(yīng)用于報(bào)告基因的分析和衛(wèi)生監(jiān)控。
熒光素適合做哪些實(shí)驗(yàn)?
熒光素鉀鹽和5-氟-熒光素,作為L(zhǎng)uciferase的作用底物,常用于以下實(shí)驗(yàn):
1. 報(bào)告基因分析
2. In vivo imaging (動(dòng)物活體成像)
3. In vitro imaging (細(xì)胞體外分析)
4. ATP測(cè)定
5. 其它luciferase及其基因相關(guān)的分析和研究工作
2、熒光素應(yīng)用于活體成像的基本原理
細(xì)胞中D-熒光素酶參與的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)遵守酶促反應(yīng)的基本原理,在底物D-熒光素鉀過量的情況下,反應(yīng)產(chǎn)生的光子數(shù)(發(fā)光量)與細(xì)胞中的D-熒光素酶的量成正相關(guān),從而可以推算出細(xì)胞的數(shù)量。
3、熒光素鉀鹽溶液的穩(wěn)定性
熒光素鉀鹽易溶于水和緩沖液,溶解度可高達(dá)25mg/mL。一般使用濃度為3-15 mg/mL。
溶液的pH值、溶液中的氧氣和保存時(shí)間對(duì)其保存過程中的穩(wěn)定性非常重要。當(dāng)溶液的pH<6.5(發(fā)生水解作用)或>7.5(發(fā)生消旋化作用,D型轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)型)的情況下,D-熒光素鉀鹽相對(duì)不穩(wěn)定。如果溶液中存在少量的氧氣,將加速D-熒光素鉀的降解速度。
D-熒光素配成溶液后,在保存條件(-80°C,pH,無氧氣)下,存在固定的降解速度:0.2%/天,因此配成溶液保存的D-熒光素應(yīng)盡量在1年內(nèi)使用完。
有水存在的情況下,主要發(fā)生消旋化作用,即D-熒光素轉(zhuǎn)化成L-熒光素,有報(bào)道稱L-熒光素對(duì)熒光素酶催化的酶促反應(yīng)有抑制作用。
4、熒光素、熒光素鈉和D-熒光素鉀之間的區(qū)別
主要區(qū)別在于溶解和分散性能。D-熒光素鉀鹽在水和緩沖液中的溶解度高,且溶解速度較快,故在一般的生物學(xué)試驗(yàn)中常用D-熒光素鉀鹽。
5、D-熒光素鉀鹽的保存和運(yùn)輸條件
保存條件:≤-20°C,避光,保持干燥。(在不打開包裝的條件下,可保存兩年時(shí)間)。
運(yùn)輸條件:高純度的D-熒光素鉀鹽可在短時(shí)間內(nèi)常溫條件下保存,運(yùn)輸條件為常溫。
原裝(沒有打開包裝)熒光素的包裝瓶中充有氬氣,保證其穩(wěn)定性,打開包裝后,請(qǐng)嚴(yán)格按照保存條件保存。
熒光素鉀鹽具有易溶于水的特性,其暴露于空氣中,易吸潮。在稱量過程中,請(qǐng)考慮其易吸潮的特性,*行溫度平衡,再快速稱取